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蛇类饮片的PCR鉴别方法
PCR为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
1 简述
1.1 本法适用于乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇饮片的PCR检测。
1.2 本项鉴别的目的在于鉴别乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇饮片的真伪。
2 仪器与用具
2.1 通用实验室仪器设备。
2.2 PCR扩增仪
2.3 电泳系统
2.4 凝胶成像系统或照相系统
2.5离心机：转速达到10000rpm/min
2.6 重蒸馏水仪
2.7 液氮、研钵
3 试液与材料
3.1 DNA提取试剂盒：Promega 公司Wizard SV Genomic DNA Purification System或上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒。
3.2 蛋白酶K（Proteinase K）：Promega公司或其它同类产品。
3.3 PCR反应试剂盒：包括Taq DNA聚合酶（5单位/μl）、四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液，10×PCR缓冲液（含25mmol/L Mg2+）。大连宝生物生物工程公司Takara Ex Taq或其它同类高保真DNA Taq 酶。
3.4 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液：将186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0（约需氢氧化钠20g），定容至1000ml。分装后高压蒸汽灭菌。
3.5 琼脂糖：AgaroseI 上海生工生物工程有限公司（A0710）或其它同类产品。
3.6 电泳缓冲液：50×TAE缓冲液：称取Tris碱242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，调节pH至8.0，定容至1000ml。使用时稀释50倍使用。
3.7 GelRedTM核酸凝胶染色剂：Biotium 公司。GelRedä 是一种具有凝胶染色特性，并被设计为替换高毒性染色剂－溴化乙锭（EB）的红色荧光核酸染色剂。
3.8 DNA分子量标记（DNA Molecular Weight Marker）：DNA marker（100bpDNA ladder）上海生工生物工程有限公司或其他同类产品或其它同类产品。
3.9 加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg，加水10ml，在室温下过夜溶解；再称取二甲苯腈蓝250mg，用10ml水溶解；称取蔗糖50g，用30ml水溶解，合并三种溶液，用水定容至100ml，在4℃中保存。PCR反应试剂盒中一般带有该试剂。
3.10 引物
3.10.1金钱白花蛇引物：
5’GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3’
5’GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA3’
3.10.2蕲蛇引物：
5’GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3’
5’CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3’
3.10.3乌梢蛇引物：
5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’
5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’
3.10.4 引物溶液：引物由专业生物公司合成，纯化方式为PAGE级。用无菌双蒸水分别将上述引物稀释到10μmol/L，开盖前10000rpm/min离心1min。
4 模板DNA提取
采用Promega Wizard SV Genomic DNAPurification System试剂盒。
4.1 取供试品适量（约0.5g），去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取适量（约0.1g）至1.5mL离心管中；
4.2 加入275μl消化液，比例如下：
Nuclei lysis Solution 200μl
0.5M EDTA 50μl
Proteinase K（20mg/mL） 20μl
RNaseA Solution 5μl
总体积 275μl
① 放置55℃ 水浴中温育1hr；
② 取出后加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，混匀后将溶液全部转移入过滤柱中，10000rpm离心3min；
③ 弃掉过滤液，加入800μl洗脱液，10000r/min离心1min；
④ 弃掉过滤液，反复清洗3次，每次10000r/min离心1min；
⑤ 弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μl无菌双蒸水，室温放置2min后10000r/min离心2min。
⑥ 滤液-20℃保存备用。
5 PCR反应与凝胶成像分析
5.1 配制PCR反应体系
在冰上溶解10×PCR缓冲液、dNTP和引物，并配制下列反应体系。其中Taq DNA聚合酶临用时取出，避免反复冻溶。
在200μl PCR反应管中依次加入：
10×PCR缓冲液 2.5μl
dNTP（2.5mM） 2μl
引物（10μM） 0.5μl
Taq DNA聚合酶（Takara公司，ExTaq 5U. μl-1） 0.2μl
模板（约100ng） 0.5μl
无菌双蒸水 19.3μl
总体积 25μl
5.2 PCR反应参数
以4000r/min离心10s后，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：
乌梢蛇、蕲蛇：
95℃预变性 5min
95℃ 30s
63℃ 45s
72℃后延伸 5min
金钱白花蛇：
95℃ 预变性5min
95℃ 30s
55℃ 45s
72℃后延伸 5min
PCR反应结果后，对反应产物进行电泳检测或在4℃保存。
5.3 对照PCR的选择和建立
在试样PCR反应的同时，应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
阳性对照是指用经过中国药品生物制品检定所鉴定的正品药材提取的DNA作为PCR反应的模板；阴性对照是指用相应的伪品金钱白花蛇（赤练蛇），伪品乌梢蛇（灰鼠蛇）、伪品蕲蛇（眼镜蛇）提取的DNA作为PCR反应的模板；空白对照是指用无菌双蒸水作为PCR反应体系的DNA模板。上述对照PCR反应体系中，除模板外其余组分与5.2相同。
5.4 电泳检测
将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1.5%的溶液，然后按每100ml琼脂糖溶液中加入10μl GelRedTM溶液的比例，加入GelRedTM溶液，混匀后将其倒入制胶器中，室温下凝固成凝胶后，取出胶板，放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中。在每个泳道中加入8μl的PCR产物（和2μl加样缓冲液混合），其中一个泳道中加入DNA分子量标记，接通电源按5V/cm恒压进行电泳20min，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。
5.5 凝胶成像分析
电泳结束后，将凉脂糖凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
6结果判断
在阴性对照和空白未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带情况下，如试样出现相应大小扩增带则可判定该试样为阳性结果。
乌梢蛇：300～400之间（350bp）
蕲蛇：200～300之间（291bp）
金钱白花蛇：500～600bp之间（507bp）
如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则该样品可判断为伪品。 |
